Identificación de microorganismos
Una de la tareas fundamentales del laboratorio de microbiología
es la aplicación de una metodología precisa que permita la identificación de
los microorganismos implicados en procesos clínicos asociados a infecciones o
de aquellos que tienen relación con el hombre
Se presentan tres maneras diferentes de abordar la identificación
bacteriana:
i.
métodos fenotípicos o tradicionales,
ii.
métodos moleculares : procedimientos
complementarios, alternativos o incluso de referencia a los fenotípicos, ya que
una misma cepa puede generar diferentes características
iii.
métodos basados en proteínica. : s el estudio y caracterización del conjunto de proteínas
expresadas por un genoma (proteoma). Las técnicas de proteómica abordan el
estudio de este conjunto de proteínas y las más usadas se basan en la
electroforesis y en la espectrometría de masas.
Aunque no son los únicos, son los más importantes y los que
mayor impacto tienen
En el desarrollo de este blog nos centraremos más en abarcar
el método fenotípico
Fenotípicos
Los esquemas tradicionales de identificación fenotípica
bacteriana se basan en las características observables de las bacterias, como
su morfología, desarrollo, y propiedades bioquímicas y metabólicas.
En ningún caso, los métodos de identificación fenotípica
pueden proporcionar una certeza absoluta. Únicamente indicarán cual es el género
y/o la especie a la que la bacteria identificada tiene mayor probabilidad de
pertenecer.
Características microscópicas
Características
macroscópicas: morfología y hemólisis; Cultivo: Medios de cultivo y requisitos
de crecimiento en relación a atmósfera, temperatura y nutrición.
Pasos
1.
conseguir un cultivo puro(axenico)
2. observación microscópica de la bacteria aislada
3.
por medio de la tinción
4.
aspectos del crecimiento en el medio
5.
Realización de pruebas de identificación
6.
Se inicia el proceso de identificación con pruebas
primarias, que son rápidas y sencillas de realizar: Gram, morfología, catalasa,
oxidasa, oxidación -fermentación, fermentación de glucosa, producción de
esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad
7.
Determinación del serotipo al que pertenece
Tinción
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal
que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal
dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y
el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
En resumen la tinción es el proceso por el cual las moléculas
de un colorante se adsorben a una superficie. El uso de colorantes permite
cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la
observación en microscopio óptico.
La fijación produce habitualmente el encogimiento de las
células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores
que lo que es realmente, de manera que las medidas de las células que han sido
fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.
Según la manipulación que efectuemos sobre la muestra a
observar y según los colorantes que empleemos durante el proceso, podemos
hablar de diferentes modalidades de tinción.
Examen directo (Sin Tinción)
No se utiliza ningún tipo
de colorante.
Es
el montaje directo húmedo o examen en fresco: las
muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para
su observación. El material que es demasiado espeso para permitir la
diferenciación de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solución
salina fisiológica estéril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la
superficie del material.
Este tipo de preparación se emplea
para detectar trofozoítos móviles de parásitos intestinales como Giardia, Entamoeba,
huevos y quistes de otros parásitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas,
hifas de hongos, etc
 |
| Candida sp en un examen en fresco. |
Tinción Simple.
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras
celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de
Loeffler, Azul de lactofenol).
El Hidróxido de potasio al 10%
(solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere
parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero
no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
La tinta china o Nigrosina permite
observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los
polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un
halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede
agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de
leucocitos.
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| Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta china. |
Tinción Diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras
celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de
acuerdo con su propia constitución química.
Los ejemplos clásicos serían
la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen
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| BGN y levaduras en una tinción GRAM |
TINCIÓN DE GRAM
Utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes
grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. Fue desarrollada
por el científico danés Hans Christian Gram en 1884.
Consiste en Tomar con un
asa una porción de cultivo bacteriano, depositarlo sobre una gota de agua y
hacer un extendido sobre un portaobjetos. Dejar secar y fijar por calor.
Ponerlo sobre un soporte y cubrirlo con una solución de violeta cristal. Luego
de 1 minuto agregar solución de iodo. Después de 1 minuto, lavar con agua.
Decolorar con alcohol 96°. Lavar con agua y cubrir con una solución de
safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Colocar una gota de aceite
para inmersión. Llevar el portaobjetos a la platina de un microscopio
 |
| pasos de la tincion de gram |
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma
distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de
sus paredes celulares
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| Bacteria Gram Negativa |
 |
| Bacteria Gram Positiva |
ZIEHL-NEELSEN (BAAR)
La tinción de Ziehl-Neelsen es la técnica comúnmente usada en el
diagnóstico rutinario de tuberculosis. Es una técnica rápida, fácil y de bajo
costo. Esta tinción permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos
que son capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido y aquellos que no
lo son.
Se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparación
ligeramente para solubilizar las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la
pared celular para que permita el paso libre del colorante
Otras tinciones de uso habitual
Tinción de Wright
La tinción de Wright es una técnica que se emplea
generalmente para la diferenciación de elementos celulares de la sangre y es
clasificada como una tinción poli cromática, dado que puede teñir compuestos
ácidos o básicos presentes en una célula.20 Fue desarrollada por el patólogo
James Homer Wright en 1902
El reactivo de Wright está compuesto por eosina y azul de
metileno, cuando éste se oxida se conoce como azur B a una concentración de 0.8
g/L empleando como solvente alcohol metílico. La eosina es un colorante ácido
que tiene afinidad por componentes alcalinos
La tonalidad resultante de la tinción con eosina es
rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo intenso en el caso de los
eritrocitos
TINCION NEGATIVA
La tinción negativa
fue desarrollada originalmente para microscopia de luz con el fi n de rodear y
delinear las bacterias no teñidas u otros materiales biológicos.
El principio es simple, ya que sólo se requiere depositar
una gota de la muestra clínica sobre un portaobjetos, posteriormente se coloca
el colorante y se observa al microscopio sin necesidad de fijación, algunas
estructuras difundirán el colorante y otras no, lo que permitirá un contraste
de las estructuras observadas. Se han utilizado diferentes colorantes: uno de
ellos es la mencionada tinta china, la cual tiñe el fondo de la muestra de un
color oscuro y la cápsula del C. neoformans permanece sin teñir.
RODAMINA-AURAMINA
Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias
poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se
fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante
contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste,
evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol
resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos
colorantes.
Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que
luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o
Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes
el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser
confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la
diferenciación morfológica.
NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea
en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de
acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la
concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital,
que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está
muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el
germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción.
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de
bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran
cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja
de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial
de hemocultivos positivos.
BLANCO DE CALCOFLÚOR
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de
calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras
muestras. Según fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea
en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos.
También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos
de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoríos ha suplantado al
azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz
blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa que se utilice.
INTEGRANTES DEL GRUPO
Benjamín de Jesús Rodríguez SámanoMaría Carmen Marcial Alva
Andrea Díaz Paniagua
Fabiola Gallegos Franco
Sarahi Maribel Rosas Caballero
Referencias
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Obtenido de Métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de
microbiología: http://revistabioanalisis.com/arxius/notas/crZD3xk7.pdf
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